Найти инфекционную «иголку» в молекулярном «стогу»

17—18 мая в Минске проходит Международная конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» Молекулярная диагностика является относительно молодым направлением исследований, получившим развитие в начале 70-х годов ХХ века.    В настоящее время широко применяются высокоэффективные молекулярные методы:   — полимеразная цепная реакция,   — блот-гибридизация,   — ДНК-секвенирование (анализ первичной последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК).   Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — «золотой стандарт» для диагностики ряда заболеваний. Была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году. Часто ее описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стогу сена и затем строить стог из этих игл. «Игла» — крошечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНК — репликацию (размножение), делает его копии. За несколько часов из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 100 млрд идентичных молекул и изучить генетический материал, присутствующий в крайне незначительных количествах.       Число моногенных болезней, которые могут быть выявлены с помощью методов молекулярной диагностики, уже превышает 1000. Причем, возможно не только диагностировать генные болезни, но и определять бессимптомных гетерозиготных носителей мутаций и, таким образом, вести эффективную профилактику болезней в семьях высокого риска. Дальнейший прогресс в этой области видится в скрининге новорожденных на предрасположенность к мультифакториальным (полигенным) заболеваниям, таким, как атеросклероз, ишемия сердца, диабет, некоторые опухоли и нервно-психические заболевания.    Известно, что раковые клетки возникают вследствие накопления мутаций в критических протоонкогенах и ассоциированных с опухолями генах-супрессорах. Обнаружить опухоль на ранних стадиях ее развития можно при исследовании крови, мочи, ряда биологических жидкостей, в которых могут быть обнаружены биомолекулы, являющиеся продуктами жизнедеятельности развивающейся опухоли или результатом реакции систем организма на появившиеся опухолевые клетки. Это удается сделать только с помощью методов молекулярной биологии, иммуногисто- и иммуноцитохимии.   Наиболее близка к практическому применению молекулярная диагностика инфекционных заболеваний. Последние десятилетия характеризуются рядом новых тенденций в динамике и структуре инфекционной заболеваемости. Во-первых, возросла роль «новых» инфекций: ВИЧ, гепатитов В и С, хламидиозов, герпеса и др.   Во-вторых, активизировались (возвратились) «старые» инфекции: туберкулез, венерические болезни (сифилис, гонорея), кишечные инфекции (дизентерия, сальмонеллез), внутрибольничные инфекции. В-третьих, инфекционными стали считаться заболевания, ранее не связываемые с инфекционными причинами: онкологические болезни (например, рак шейки матки), эндокринные и аутоимунные заболевания, болезни сердца и др.   Чрезвычайно важно налаживание и осуществление регулярного контроля за инфекциями, вкл. своевременное выявление и установление этиологии. Эффективная диагностика должна быть доступна для практического применения, точна в постановке лабораторного диагноза и быстра в исполнении. К сожалению, многие используемые в нашей стране диагностические методы устарели и их возможностей недостаточно для установления истинных причин ряда инфекций. Это касается, в первую очередь, хронических и скрыто протекающих заболеваний, возбудители которых под действием лекарственных препаратов или других причин изменили свои биологические свойства и «приспособились» для тайного существования в организме человека, которое нельзя выявить классическими диагностическими процедурами.   Вовремя обнаружить такие инфекционные агенты, а также патогены, присутствующие в человеческом организме в очень низких количествах, могут современные молекулярно-биологические методы, относящиеся к диагностическим процедурам нового поколения.   Молекулярная диагностика (генодиагностика) инфекционных болезней направлена на обнаружение генетического материала (генов) возбудителей инфекций — бактерий, вирусов, паразитарных агентов, простейших, риккетсий и др. инфекционных патогенов. Наиболее востребованным диагностическим тестом в этой области является ПЦР. Основным преимуществом ПЦР перед другими методами, в т. ч. молекулярно-биологическими, является ее высокая чувствительность, позволяющая выявлять единичные молекулы инфекционных патогенов (см. рис.). С помощью ПЦР можно диагностировать не только острые, но и хронические и латентные инфекции, а также заболевания со стертой, нетипичной клинической картиной. К числу других важных достоинств следует отнести высокую специфичность исследований (точность в обнаружении искомого генетического материала), а также возможность выявления возбудителей в короткие сроки (6–48 часов). Метод ПЦР позволяет у постели больного подтвердить или опровергнуть клинический диагноз.   В качестве исследуемого материала для ПЦР-диагностики могут использоваться любые биологические жидкости, ткани и клетки: кровь, плазма и сыворотка крови, лейкоциты, ликвор, слюна, слезная жидкость, моча, мазки, соскобы, сперма, секрет предстательной железы, биоптаты, ауто-птаты (даже в парафине), мокрота, фекальные экстракты и др. Выбор биологического материала для исследований зависит от вида диагностируемой инфекции, ее локализации, формы течения…   В перечень генодиагностируемых входит подавляющее большинство известных бактериальных, вирусных, протозойных, грибковых и паразитарных инфекций. Наиболее актуальными для нашей страны являются вирусные гепатиты (А, В, С), ВИЧ-инфекция, туберкулез, грипп и гриппоподобные заболевания, инфекции мочеполовых органов (герпес, цитомегаловирусная инфекция, инфекции, вызванные вирусами папилломы человека, хламидиоз, уреаплазмоз, трихомониаз, микоплазмоз, гонорея, сифилис), кишечные инфекции (сальмонеллезы, дизентерия, энтеро- и ротавирусные), заболевания нервной системы (герпетический, энтеровирусный, Западно-Нильский и клещевой энцефалиты, серозные менингиты и др.).   К данным классическим инфекциям можно добавить заболевания сердца — миокардиты, диллатационную кардиомиопатию (ДКМП), которые раньше не считались инфекционными, а сейчас все более настойчиво связываются с вирусными агентами. Накопленный опыт в изучении диагностической значимости маркеров энтеровирусной инфекции при этих заболеваниях свидетельствует о том, что именно генодиагностика играет решающую роль в установлении их возможных инфекционных причин.   Обнаружение в сердечных тканях больных миокардитами и ДКМП генных продуктов размножения вирусов является прямым доказательством наличия инфекции сердца. При проведении такого рода генодиагностических исследований на базе НИИ эпидемиологии и микробиологии установлено, что у 30–40% пациентов с хроническими кардитами и кардиомиопатиями имеет место инфицирование клеток сердца, что нельзя не учитывать при назначении соответствующей терапии.   Существенную роль играет молекулярная диагностика в службе крови и акушерской практике. Например, при выявлении доноров, инфицированных вирусом иммунодефицита человека или вирусом гепатита В, или диагностике краснухи и цитомегаловирусной инфекции у беременных. Важное значение методы молекулярной диагностики имеют для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях. Определение «вирусной нагрузки», т.е. количества вирусных частиц в крови позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов.   Подтверждение диагноза классическими методами бактериологического выделения возбудителя туберкулеза иногда может занимать 5–6 месяцев. ПЦР этот срок сокращает до нескольких часов. Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением.   Интереснейшая область исследования, которая открывается благодаря ПЦР-диагностике, — изучение латентной инфекции M.tuberculosis. По современной концепции туберкулезной инфекции, из 100 человек, контактирующих с M.tuberculosis, 90 могут быть инфицированы, но только у 10 развивается активная болезнь. У остальных 90% инфекция будет оставаться латентной из-за противотуберкулезного иммунитета. Положительные ответы ПЦР при отрицательных результатах посевов патологического материала отмечаются у 55% лиц, подвергавшихся бытовым контактам с M.tuberculosis, и у 80% лиц, у которых туберкулез протекал без рентгенографических проявлений. Проведение ПЦР-исследований у пациентов из групп риска позволяет выявлять больных с отрицательными результатами микроскопии и посевов, но с субклинической инфекцией M.Tuberculosis.   В последнее время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на уровне генотипа. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у бактерий генов, связанных с устойчивостью к различным препаратам. При этом наибольшие надежды на совершенствование методов определения лекарственной устойчивости патогенов связаны с развитием микрочиповой технологии, позволяющей определять устойчивость бактерий непосредственно из диагностического материала одновременно к нескольким лекарственным препаратам.   Не менее важной областью применения генодиагностических исследований является санитарная микробиология. Речь идет об использовании ПЦР для обнаружения микробного загрязнения пищевых продуктов и питьевой воды. Обнаружение в них генетического материала патогенных для человека инфекционных агентов свидетельствует о риске для здоровья. ПЦР-исследования питьевой воды и пищевых продуктов позволяют быстро и точно установить факт микробного загрязнения и возможные причины.
В здравоохранении Беларуси активно внедряется генодиагностика для установления причин инфекционных заболеваний, механизмов, путей и факторов их передачи. Однако существуют причины, препятствующие широкому внедрению ПЦР-исследований: крайне мало грамотно организованных эффективных ПЦР-лабораторий и хорошо обученных специалистов, недостаточный опыт интерпретации результатов ПЦР-анализов врачами-клиницистами.   В выигрышной ситуации находятся учреждения, в силу своей специфики осваивающие и широко использующие молекулярно-биологические методы в научно-исследовательских целях. В их числе и НИИЭМ. Лаборатории института активно занимаются ПЦР-диагностикой инфекционных заболеваний, в т. ч. вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, ИППП, кишечных, особо опасных и природно-очаговых инфекций, болезней нервной и сердечно-сосудистой систем. Ежегодно проводится около 2 000 ПЦР-исследований, в т. ч. в рамках оказания медуслуг по договорам с ЛПУ и обращениям граждан.   На открывшейся сегодня в Минске международной конференции будут обсуждаться актуальные проблемы молекулярной диагностики туберкулеза и других бактериальных инфекций, гриппа и респираторных заболеваний человека, гриппа птиц, вирусных гепатитов, ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекционных заболеваний, кишечных, природно-очаговых и ООИ, ИППП. Особое внимание будет уделено современным диагностическим тест-системам и оборудованию для молекулярно-генетического анализа, стандартизации и государственного контроля их качества. 
 

Подготовлено Галиной Гульской
Источник -medvestnik.by

Комментарии закрыты.